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测序知识小科普:常用测序方式简介

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点击次数:560 更新时间:2019年06月06日15:08:54 打印此页 关闭

.什么是高通量测序?

高通量测序技术(High-throughput sequencingHTS)是对传统 Sanger 测序(称为一代测序技术)革命性的改变,一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencingNGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)

.什么是 Sanger 法测序(一代测序)?

Sanger 法测序利用一种 DNA 聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于 ddNTP 缺乏延伸所需要的 3-OH 基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在 GAT C 处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种 dNTPs ddNTPs 的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后可用 X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

.什么是基因组重测序(Genome Re-sequencing)?

全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序,并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低,人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序,实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点,以及结构变异等,具有重大的科研和产业价值。

.什么是 de novo 测序?

de novo 测序也称为从头测序:其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序,利用生物信息学分析手段对序列进行拼接,组装,从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展,基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低,大规模基因组测序渐入佳境,基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力,可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。

.什么是外显子测序(whole exon sequencing)?

外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域 DNA 捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低,对研究已知基因的 SNPIndel 等具有较大的优势,但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。

.什么是 mRNA 测序 (RNA-seq)?

转录组学(transcriptomics)是在基因组学后新兴的一门学科,即研究特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有 RNA(包括 mRNA 和非编码 RNA)的类型与拷贝数。Illumina 提供的 mRNA 测序技术可在整个 mRNA 领域进行各种相关研究和新的发现。mRNA 测序不对引物或探针进行设计,可自由提供关于转录的客观和权威信息。研究人员仅需要一次试验即可快速生成完整的 poly-A 尾的 RNA 完整序列信息,并分析基因表达、cSNP、全新的转录、全新异构体、剪接位点、等位基因特异性表达和罕见转录等最全面的转录组信息。简单的样品制备和数据分析软件支持在所有物种中的 mRNA 测序研究。

.什么是 small RNA 测序?

Small RNAmicro RNAssiRNAs pi RNAs)是生命活动重要的调控因子,在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。Illumina 能够对细胞或者组织中的全部 Small RNA 进行深度测序及定量分析等研究。实验时首先将 18-30 nt 范围的Small RNA 从总 RNA 中分离出来,两端分别加上特定接头后体外反转录做成 cDNA 再做进一步处理后,利用测序仪对 DNA 片段进行单向末端直接测序。通过 Illumina Small RNA 大规模测序分析,可以从中获得物种全基因组水平的 miRNA 图谱,实现包括新miRNA 分子的挖掘,其作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、miRNAs 聚类和表达谱分析等科学应用。

.什么是 miRNA 测序?

成熟的 microRNAmiRNA)是 17~24nt 的单链非编码 RNA 分子,通过与 mRNA 相互作用影响目标 mRNA 的稳定性及翻译,最终诱导基因沉默,调控着基因表达、细胞生长、发育等生物学过程。基于第二代测序技术的 microRNA 测序,可以一次性获得数百万条 microRNA序列,能够快速鉴定出不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已知和未知的 microRNA及其表达差异,为研究 microRNA 对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。

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